淺析熒光素酶檢測試劑盒實驗步驟

　　熒光素酶檢測試劑盒是生物體內催化熒光素或者脂肪醛氧化發光的一類酶的總稱，可以從細菌、螢火蟲、海星等生物中提取出來。熒光素酶的這種催化底物產生自發熒光的特性可以靈敏地檢測基因的表達。

 

　　可分別催化各自的底物發出不同顏色的熒光，且兩種光吸收波長不同，檢測互不干擾，因此可在同一個化學反應體系中同時使用，作為雙熒光素酶報告基因系統使用，已成為研究轉錄因子參與基因調控的有效手段,通過對啟動子DNA片段的分析,驗證啟動子結合元件的反式激活能力,探討轉錄因子在信號轉導中的分子機制。

 

　　熒光素酶檢測試劑盒實驗步驟：

　　（1）用生物信息學方法分析并預測啟動子區可能的轉錄因子結合位點（若目標是檢測miRNA及其靶基因的靶向作用，則需要預測兩者結合位點）。

　　（2）設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質粒（如pGL3-basic）中。

　　（3）篩選陽性克隆，測序。擴增克隆并提純質粒備用。

　　（4）擴增轉錄因子質粒，提純備用。同時準備相應的空載質粒對照，提純備用。

　　（5）培養293（或其它目的細胞），并接種于24孔板中，生長10-24小時。

　　（6）將報告基因質粒與轉錄因子表達質粒共轉染細胞。

　　（7）質粒共轉染48h后，棄去培養基，用100μl1XPBS洗1遍。

　　（8）傾斜96孔板，吸干剩余的PBS。

　　（9）去離子水將5XPLB稀釋成1XPLB，使用前放到常溫。

　　（10）每孔加50μl稀釋好的1XPLB，搖床常溫條件下搖15min，進行裂解。

　　（11）白色不透光的96孔酶標板中每孔加步驟（10）的上清液10μl，加入100μl預先混好的LARII，2s后測數據。

　　（12）每孔添加100μl預先混好的Stop&GloReagent，靜止2s后，測數據。